バイオフィルムとは微生物自身が生成する細胞外代謝産物により、界面や生体等の固体表面に付着して存在している微生物の集合体のことで、至る所に存在し, 様々な問題を引き起こしている。下水管の腐食や膜による水処理において問題となっているバイオファウリングは、このバイオフィルムによるものだと考えられている。これらのバイオフィルムは物質表面に強固に付着しており、化学物質に対して耐性を持つため、完全な除去が困難である。バイオフィルムの完全な除去を実現するためには、微生物がバイオフィルムを形成するプロセスを理解する必要があるが、今のところそのメカニズムはほとんど解っていない。そこで本研究室では、このバイオフィルムの形成機構を遺伝子レベルで解析し、その解明を試みている。
研究内容紹介
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論文情報
Membrane fouling potentials and cellular properties of bacteria isolated from fouled membranes in a MBR treating municipal wastewater
Ishizaki, S., Fukushima, T., Ishii S., Okabe, S.
Water Research, 2016, 100, 448-457.
膜分離活性汚泥処理槽(MBR)は、高度な処理水質の確保ができる、運転管理が容易である、施設の小規模化が図れるなど多くの利点を有する一方で、膜ファウリングによる消費エネルギー及び運転コストの増大が懸念されている。MBR槽内に存在する菌及びその代謝産物が膜ファウリングの進行に大きく寄与することが知られている一方で、どのような菌が高い膜ファウリング進行能力を有するのかは分かっていない。そこで本論文では、都市下水を処理する浸漬型MBRより単離した菌の膜ファウリング進行能力をクロスフローリアクターで評価し，膜ファウリング進行菌(Fouling-causing bacteria: FCB)の特定および特徴解明を試みた。膜ファウリング進行能力を評価した結果、FCBはEnterobacteriaceaeやMicrobacteriaceaeなど多様な科(family)に属していた。16S rRNA遺伝子が99%以上相同する菌間でも膜ファウリング進行能力が大きく異なることから、16S rRNA遺伝子配列に基づいた菌相解析の結果のみでは膜ファウリング進行菌を予測することは困難と言える。一方、FCBはコロニーの含水量が高く、親水性有機物および多糖を多く生産する傾向にあることが分かった。FCBによる膜ファウリング進行メカニズムの理解を促進することは、より効率的な膜ファウリング抑制技術の開発および最適化に役立つと思われる。
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論文情報
Impacts of hydrophilic colanic acid on bacterial attachment to microfiltration membranes and subsequent membrane biofouling
Yoshida, K., Tashiro, Y., May, T. and Okabe, S.
Water Research, 2015, 76, 33-42.
膜分離活性汚泥法の普及には膜の目詰まり（ファウリング）の効率的な制御が不可欠であり、そのためにはファウリングの発生機構の理解が重要である。膜ファウリングの原因物質である微生物の代謝物（細胞外ポリマー）は多様な多糖成分を含んでおり、この内一部の多糖類が膜ファウリングに大きく影響することが近年報告されているが、個々の多糖が膜ファウリングに与える影響は明らかになっていない。本研究では、バイオフィルム形成に関与することが報告されている親水性多糖コラン酸に着目し、コラン酸を生産する・生産しない大腸菌株を用いてコラン酸が菌体の膜への付着と膜ファウリングに与える影響を評価した。その結果、コラン酸は菌体表面を親水化することで菌体の膜への付着を抑制するが、膜ファウリングを促進した（膜孔閉塞）。さらに、コラン酸はろ過膜上のバイオフィルムを貫通し、直接、膜孔閉塞することを明らかにした。本研究は、細胞外ポリマー成分の内、親水性多糖コラン酸とその構造類似多糖がろ過膜上のバイオフィルムの有無に関わらず、不可逆ファウリング（膜孔閉塞）を引き起こすことを示唆し、多糖類による膜ファウリングの発生機構の基礎的知見となるものである。
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論文情報
RelE-mediated dormacy is enhanced at high cell density in Escherichia coli
Tashiro, Y., Kawata, K., Taniuchi, A., Kakinuma, K., May, T., and Okabe, S.
Journal of Bacteriology, 2012, 194(5), 1169-1176.
幾つかの細菌は、バイオフィルム状態などの高菌体密度時に休眠化することで薬剤耐性能を獲得する。大腸菌においては、数組のトキシン-アンチトキシンシステムがこの休眠化に関与しているが、休眠化移行の詳細なメカニズムについては未解明な部分が多い。本論文では、トキシンRelE を介した細菌の休眠化が高菌体密度時に顕著に引き起こされることを明らかにした。ラムノース添加の有無によりRelE 発現を調節できる菌株を作製し、菌体密度と細菌の休眠化との関係を調べたところ、高菌体密度時に休眠細胞の割合は高くなり、殺菌性抗生物質への耐性を有する細胞の数も増加していた。さらに、高菌体密度時におけるRelE を介した休眠化は、アミノ酸欠乏と未知の熱可塑性細胞外物質が影響していることが示唆された。このように、細菌は集団となる事で低菌体密度時には発揮できなかった薬剤耐性能を獲得するシステムを備えている。本研究の結果は細菌の休眠化移行における一つのメカニズムを提唱しており、薬剤耐性細菌の制御に重要な知見であろう。
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論文情報
Enterobactin is required for biofilm development in reduced-genome Escherichia coli
May, T., and Okabe, S.
Environmental Microbiology, 2011, 13(12), 3149-3162.
大腸菌のバイオフィルム発達には様々な細胞表層構造やクォラムセンシングが関与している。しかし、大腸菌ゲノムの17.6%を欠く「最少ゲノム大腸菌」は、I 型繊毛、アミロイド状タンパク質、及び多糖などの細胞表層構造やオートインデューサー2 情報伝達機構を欠くものの、成熟したバイオフィルムを形成する。このメカニズムを解明する目的で網羅的な転写解析を行ったところ、この菌株はバイオフィルム形成の各増殖段階で異なるアミノ酸合成を行っている事が示唆された。また、最少ゲノム大腸菌のバイオフィルム形成にはentB, marR, dosC, mcbR, yahKといった遺伝子が関与する事が示された。その中で、エンテロバクチンをコードするentB、推定酸素還元型酵素をコードするyahK がバイオフィルムの成熟に関与する因子である事が初めて明らかとなった。このように最少ゲノム大腸菌は個々の遺伝子の表現型を特定するツールとして有用であり、本研究では新たなバイオフィルム関連因子の発見を可能にした。
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Exposure of conjugative plasmid carrying Escherichia coli biofilms to male-specific bacteriophages
May, T., Tsuruta, K., and Okabe, S.
The ISME Journal, 2011, 5(4), 771-775.
Fプラスミドを有する大腸菌はF-piliを介した交配対を形成するが、この現象はバイオフィルム形成初期に関わる因子の一つである。本研究では、F特異バクテリオファージである繊維状ファージ(f1)および20面体ファージ(MS2)がバイオフィルム形成に対して及ぼす影響について解析した。形成初期段階にあるバイオフィルムにf1ファージを添加すると、その発達は完全に抑制されたが、MS2ファージの添加ではそのような影響は見られなかった。この結果から、交配対はF-piliの先端の吸着により形成されるものであり、F-piliの側表面は強く関与しないものと言える。一方、成熟したバイオフィルムに対してf1ファージを添加した場合、抑制現象は見られなかった。このことから、f1による影響は対象のバイオフィルムの成熟度依存的であると言えるが，これは成熟したバイオフィルム内部では交配対は既に形成されており、さらにcurli繊維等のEPS発現が進行していたことが影響したものと考えられた。F-pili接合を完了した交配対は、f1の感染を免れるようである。今回得られた結果は、バイオフィルム内部におけるF因子の存在とF特異ファージとの密接な関係を示したと同時に、バイオフィルム制御に向けた応用の可能性を示唆するものであると言える。
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論文情報
Characterization and global gene expression of F- phenocopies during Escherichia coli biofilm formation
Thithiwat May, Akinobu Ito, and Satoshi Okabe
Molecular Genetics and Genomics, 2010, 284, 333-342.
バイオフィルム中における遺伝子水平伝播の生態学的役割についての研究が近年行われており、接合伝達自体がF線毛を介してバイオフィルム形成を促進することが報告されている。本研究では、接合性Fプラスミドを保持するE. coli（F+）が形成するバイオフィルムにおいて、接合がバイオフィルム形成に与える影響を評価した。その結果、バイオフィルム形成の初期段階において、F+細胞間における線毛を介した相互作用が重要な役割を果たしていることが示された。異なる増殖段階のE. coliが同時に存在しているバイオフィルム中では、主に定常期後期のF+細胞がF-の表現型を模写した状態をとることによりF+細胞間の相互作用が生じていた。網羅的な転写解析の結果、バイオフィルム状態の細菌とF-表現型模写状態の細菌で共通の特異的遺伝子発現パターンが見られた。F-表現型模写状態の細菌では、表面排除タンパク質とDNA転移機構を抑制してF因子伝播オペロンを制御するゲノム遺伝子領域（ストレス応答・二成分制御系）が特異的に発現されていた。しかしながら交配に必要なタンパク質は安定であり、結果的にF+細胞間の線毛構築が促進されていた。これらのことから、F-表現型模写現象はバイオフィルム形成における細菌の有効な適応行動であると考えられる。
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論文等（2008-）
- Membrane fouling induced by AHL-mediated soluble microbial product (SMP) formation by fouling-causing bacteria co-cultured with fouling-enhancing bacteria
Ishizaki, S., Sugiyama, R., Okabe, S.
Scientific Reports, 2017, 7, 8482. - Generation of small colony variants in biofilms by Escherichia coli harboring a conjugative F plasmid
Tashiro, Y., Eida, H., Ishii, S., Futamata, H., Okabe, S.
Microbes and Environments, 2017, 32, 40-46. - Membrane fouling potentials and cellular properties of bacteria isolated from fouled membranes in a MBR treating municipal wastewater
Ishizaki, S., Fukushima, T., Ishii S., Okabe, S.
Water Research, 2016, 100, 448-457. - Impacts of hydrophilic colanic acid on bacterial attachment to microfiltration membranes and subsequent membrane biofouling
Yoshida, K., Tashiro, Y., May, T. and Okabe, S.
Water Research, 2015, 76, 33-42. - RelE-mediated dormancy is enhanced at high cell density in Escherichia coli
Tashiro, Y., Kawata, K., Taniuchi, A., Kakinuma, K., May, T., and Okabe, S.
Journal of Bacteriology, 2012, 194(5), 1169-1176. - Enterobactin is required for biofilm development in reduced-genome Escherichia coli
May, T., and Okabe, S.
Environmental Microbiology, 2011, 13(12), 3149-3162.. - A polyphasic approach to study eco-physiology of complex multispecies nitrifying biofilms
Okabe, S., Satoh, H., and Kindaichi, T.
Methods in Enzymology, 2011, 496, 163-184. - Exposure of conjugative plasmid carrying Escherichia coli biofilms to male-specific bacteriophages
May, T., Tsuruta, K., and Okabe, S.
The ISME Journal, 2011, 5(4), 771-775. - Characterization and global gene expression of F- phenocopies during Escherichia coli biofilm formation
May, T., Itoh, A., and Okabe, S.
Molecular Genetics and Genomics, 2010, 284, 333-342. - Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms
Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., and Okabe, S.
Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(12), 4093-4100. - Localized expression profiles of rpoS in Escherichia coli biofilms
Ito, A., May, T., Taniuchi, A., Kawata, K., and Okabe, S.
Biotechnology and Bioengineering, 2009, 103(5), 975-983. - Induction of multidrug resistance mechanism in Escherichia coli biofilms by interplay between tetracycline and ampicillin resistance genes
May, T., Ito, A., and Okabe, S.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2009, 53(11), 4628-4639. - A biofilm model for prediction of pollutant transformation in sewers
Jiang, F., Leung, D. H. W., Li, S. Y., Chen, G. H., Okabe, S., and van loosdrecht M. C. M.
Water Research, 2009, 43(13), 3187-3198. - Significance of rpoS during maturation of Escherichia coli biofilms
Ito, A., May, T., Kawata, K., and Okabe, S.
Biotechnology and Bioengineering, 2008, 99(6), 1462-1471. - Escherichia coli harboring a natural IncF conjugative F-plasmid develops complex mature biofilms by stimulating synthesis of colanic acid and curli
May, T., and Okabe, S.
Journal of Bacteriology, 2008, 190(22), 7479-7490.
